TCSPC技术测量荧光寿命原理

1、时间相关单光子计数器工作原理

TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting)是目前主要应用的荧光寿命测定技术。荧光寿命通常在ps~us量级,在如此短的时间量级上进行测量,TCSPC是最为成熟准确的测试手段。TCSPC 的工作原理如图1 所示,使用一个同步信号源驱动激光器,出射光脉冲照射样品池,在利用光子探测装置(多为PMT)对荧光信号进行探测,每一个光子计数信号在FT1010中都会落入一个对应的时间窗口,经过一定时间的统计叠加后即得到荧光寿命曲线。几十万次重复以后,不同的时间通道累积下来的光子数目不同。以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。

 

图1 荧光寿命测试原理

 

图2 TCSPC工作原理

 

 

2、荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0个荧光分子到其激发态,处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和knr,则激发态衰减速率可表示为:

其中n(t)表示时间t时激发态分子的数目,由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。荧光寿命定义为衰减总速率的倒数:

荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为:

其中I0是时间为零时的荧光强度,τ为荧光寿命。也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态,有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态,这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。

 

3、荧光寿命测定中的数据处理
由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述:

式中ai为第i项的指前因子。衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。当所测量的荧光寿命较短时,实验数据就和光源的脉冲宽度,光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。为了去掉仪器响应对测量结果的影响,需要解下面的积分方程:

样品的实测荧光衰减曲线N,实际上为L与脉冲响应函数I的卷积,即利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I(t),进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ) 等有关参量。实际工作中一般以胶体SIO2 (商品名Ludox) 为虚拟样品进行测定,仪器响应函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。

 

——星秒光电(SIMINICS)

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